Small guide antisense nucleic acid and use thereof

ABSTRACT

A nucleic acid medicine for managing a disease or disorder related to unwanted gene expression. A technique for efficiently regulating gene expression in a cell using a relatively short oligonucleotide, by establishing a method for designing a nucleic acid medicine, that includes performing structural analysis based on sequence information of a target RNA sequence as an object for gene expression regulation, calculating the probability of existence of each structure from the results of the structural analysis and the energy of each structure, and calculating the existence probability in unified fashion of an endogenous stem-loop substructure, thereby specifying a more favorable endogenous stem-loop substructure. This technique can theoretically be applied to regulation expression of any gene, and is useful for treatment or prevention of various diseases and disorders.

CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

The present application is an application claiming priority to JP2017-166641 (filing date: Aug. 31, 2017), which is incorporated hereinby reference in its entirety.

TECHNICAL FIELD

The present invention relates to regulation of gene expression usingoligonucleotides. More specifically, it relates to pharmaceuticalcompositions comprising relatively short oligonucleotides for regulatinggene expression and use thereof in disease treatment. The presentinvention also relates to a method of designing relatively shortoligonucleotides for regulation of gene expression.

BACKGROUND ART

In the drug discovery technology in drug development, conventionallymost efforts have been made to use proteins as a drug target in drugdiscovery, and the focus of drug discovery was medicine includingsmall-molecule medicine and antibody, and peptide medicine. Since thecauses of diseases have been elucidated at the gene level in recentyears in genome analysis and personalized medicine, efforts have beenmade to develop nucleic acids as targets of drug discovery. Nucleic acidmedicine is thought to be able to deal with tough therapeutic targets bysmall-molecule drugs and antibody drugs and is thus expected as a newmodality (drug discovery method).

As basic research, research on antisense nucleic acids and RNAi (RNAinterference) (Non-patent Document 1) was conducted, and drugdevelopment based on the technology was carried out, and market productsare also beginning to be released. In addition, functions of nucleicacids that do not carry protein-coding genetic information are beingelucidated, and application thereof to the drug discovery technology asgene expression regulation technology is progressing for miRNA(microRNA) (Non-patent Document 2).

In antisense nucleic acid technology, Nashimoto et al. have developed agene expression suppression technique named TRUE gene silencing (tRNaseZ^(L)-utilizing efficacious gene silencing) (Patent Documents 1-3,Non-patent Documents 3-10). This TRUE gene silencing is based on theunique enzymatic properties of mammalian tRNase Z^(L) that any RNA canbe cleaved at any point by recognizing pre-tRNA-like or micropre-tRNA-like complexes formed by target RNAs and synthetic small guideantisense nucleic acids. In particular, TRUE gene silencing has beenreported for human BCL-2, WT-1, and CCND-1 when the synthetic smallguide antisense nucleic acid has seven bases (Non-patent Documents 5-8).The effect of TRUE gene silencing is comparable to RNA interference (RNAinterference: RNAi) (Non-patent Document 9) and has also been confirmedto outperform the effect of RNAi in some cases (Non-patent Document 10).

CITATION LIST Patent Documents

-   Patent Document 1: Japanese Patent No. 3660718-   Patent Document 2: Japanese Patent No. 5959522-   Patent Document 3: Japanese Patent No. 5995849

Non-Patent Documents

-   Non-patent Document 1: Chery, J. (2016) RNA therapeutics: RNAi and    antisense mechanisms and clinical applications. Postdoc J. 4(7):    35-50 Non-patent Document 2: Rupaimoole, R. & Slack, F. J. (2017)    MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of    cancer and other diseases. Nature Review Drug Discovery, 16, 203-221-   Non-patent Document 3: Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N.,    Daikuhara, Y., Ochi, K. and Nashimoto, M. (2003) Intracellular mRNA    cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methylRNA    heptamers. Nucleic Acids Res., 31, 4354-4360.-   Non-patent Document 4: Habu, Y., Miyano-Kurosaki, N., Kitano, M.,    Endo, Y., Yukita, M., Ohira, S., Takaku, H., Nashimoto, M. and    Takaku, H. (2005) Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral    vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage    by tRNase ZL. Nucleic Acids Res., 33, 235-243.-   Non-patent Document 5: Takako Sano, Masayuki Takahashi, Tadasuke    Nozaki, Yoshiaki Takahashi, Masato Tamura, and Masayuki    Nashimoto. (2011) Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for    TRUE gene silencing. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 416,    427-432.-   Non-patent Document 6: Masayuki Takahashi, Reyad A. Elbarbary, Aiko    Nakashima, Mayumi Abe, Norihiro Watanabe, Miwako Narita, Masuhiro    Takahashi, Masato Tamura, Tetsuo Yoshida, and Masayuki    Nashimoto. (2013) A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2    mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Letters 328,    362-368.-   Non-patent Document 7: Norihiro Watanabe, Miwako Narita, Akie    Yamahira, Tomoyo Taniguchi, Tatsuo Furukawa, Tetsuo Yoshida, Tatsuya    Miyazawa, Masayuki Nashimoto, and Masuhiro Takahashi. (2013)    Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing    using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Research 37,    580-585.-   Non-patent Document 8: Satoshi lizuka, Nobuhiko Oridate, Masayuki    Nashimoto, Satoshi Fukuda, and Masato Tamura. (2014) Growth    inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA    targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One    9, e114121.-   Non-patent Document 9: Nakashima, A., Takaku, H., Shibata, H. S.,    Negishi, Y., Takagi, M. Tamura, M. and Nashimoto, M. (2007) Gene    silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of    small guide RNA. Gene Therapy, 14, 78-85.-   Non-patent Document 10: Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M. and    Nashimoto, M. (2009) Inhibition of vascular endothelial growth    factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. and Biophys. Res.    Commun., 379, 924-927.

SUMMARY OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention

One of the objectives of the present invention is to providepharmaceutical compositions comprising relatively short oligonucleotides(small guide antisense oligonucleotides; hereafter also called sgASO)for regulating gene expression and methods of disease treatment usingthereof. Also, for the objectives of the present invention, the presentinvention includes providing a method of designing relatively shortoligonucleotides for modulating gene expression.

In TRUE gene silencing, in order for the small guide antisenseoligonucleotide (sgASO) used as an active agent to bind target RNA andform a tRNaseZ^(L)-substrate structure, it is necessary that at leastone intrinsic stem-loop structure should be formed in the target RNAsequence, and it requires a step of identifying such sequences in thetarget RNA sequence. However, to date, no technique has been developedto comprehensively analyze secondary structures such as stem-loopstructures or their stability from the primary sequence of the targetRNA, with a level of precision to utilize in such drug discoverytechnology. In the present invention, one of the challenges is toprovide a method of identifying sequences in the target RNA sequence, sothat the sgASO binds to the target RNA, and at least one stem-loopstructure is formed to become a substrate for tRNaseZ^(L).

Means for Solving the Problems

The present inventors performed a structural analysis of the target RNAsequences subject to gene expression regulation based on the sequenceinformation. Then, each of the existence probabilities was calculatedfrom the obtained structural analysis results and their respectiveenergy levels.

By establishing a way of identifying a more favorable intrinsicstem-loop structure and designing sgASO by uniformly calculating theexistence probabilities of intrinsic stem-loop substructures, thepresent inventors have developed a method to efficiently regulateintracellular gene expression by using relatively shortoligonucleotides. The present invention is based on such a techniquedeveloped by the present inventors and encompasses the embodimentsbelow.

Embodiment 1

A method for cleaving a target RNA in a eukaryotic cell, comprising:

-   -   i) identifying a sequence in the target RNA sequence where at        least one stem-loop structure is formed by hybridization of a        complementary 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) to the        target RNA, and    -   ii) preparing the sgASO and contacting it with the target RNA in        the eukaryotic cell,        wherein the stem-loop structure formed through sgASO        hybridization is recognized by tRNaseZ_(L) within the eukaryotic        cell to cleave the target RNA.

Embodiment 2

The method according to embodiment 1, wherein the number of base pairsin the stem portion of the stem-loop structure formed through sgASOhybridization is 11 to 14.

Embodiment 3

The method according to embodiment 1 or 2, wherein the number of basepairs in the stem portion of the stem-loop structure formed throughsgASO hybridization is 12.

Embodiment 4

The method according to any of embodiments 1-3, wherein the sgASO is a7-mer.

Embodiment 5

The method according to any of embodiments 1-4, wherein in the stem-loopstructure formed through sgASO hybridization, the number of base pairsin the stem portion formed by the target RNA is 5.

Embodiment 6

The method according to any of embodiments 1-5, wherein in the stem-loopstructure formed through sgASO hybridization, the loop portion is formedby the target RNA.

Embodiment 7

The method according to any of embodiments 1-6, wherein the number ofbases in the loop portion of the stem-loop structure formed throughsgASO hybridization is 3 to 10.

Embodiment 8

The method according to any of embodiments 1-7, wherein the number ofbases in the loop portion of the stem-loop structure formed throughsgASO hybridization is 4 to 8.

Embodiment 9

The method according to any of embodiments 1-8, wherein the number ofbases in the loop portion of the stem-loop structure formed throughsgASO hybridization is 7.

Embodiment 10

The method according to any of embodiments 1-9, wherein the sgASO isfully complementary to the target RNA.

Embodiment 11

The method according to any of embodiments 1-10, wherein the stemportion of the stem-loop structure formed through sgASO hybridizationdoes not contain a mismatch or bulges.

Embodiment 12

The method according to any of embodiments 1-10, wherein the stemportion of the stem-loop structure formed through sgASO hybridizationcontains a mismatch or bulges.

Embodiment 13

The method according to embodiment 12, wherein in the counting of thenumber of base pairs in the stem portion, when the number of base pairsin the mismatch or bulges of the stem is 2 or less, the mismatch orbulges is considered to form a base pair and counted; and when thenumber of base pairs in the mismatch or bulges of the stem is 3 or more,half of the number of bases in the mismatch or bulges is counted as basepairs.

Embodiment 14

The method according to any of embodiments 1-13, wherein the target RNAis mRNA or ncRNA.

Embodiment 15

The method according to any of embodiments 1-14, wherein the target RNAis RNA from the nuclear genome DNA.

Embodiment 16

The method according to any of embodiments 1-14, wherein the target RNAis RNA from the mitochondrial genome DNA.

Embodiment 17

The method according to any of embodiments 1-14, wherein the target RNAis RNA from a viral or bacterial genome DNA and RNA.

Embodiment 18

The method according to any of embodiments 1-17, wherein the sgASOcomprises a modified nucleoside and/or a modified internucleosidelinkage.

Embodiment 19

The method according to any of embodiments 1-18, wherein the differencein the number of bases between the 5′ terminal sequence and 3′ terminalsequence of the stem portion formed by the target RNA is 1 or less.

Embodiment 20

The method according to any of embodiments 1-19, wherein one or both ofthe terminal hydroxyl groups of the sgASO are modified.

Embodiment 21

The method according to any of embodiments 1-20, wherein a phosphategroup is added to one or both of the terminal hydroxyl groups of thesgASO.

Embodiment 22

The method according to any of embodiments 1-21, wherein when the basesconstituting the sgASO-bound region on the target RNA from the 5′terminal are N1, N2, N3, N4, N5, N6 and N7, and further the first baseadjacent to the 3′ terminal of the region to which the sgASO binds isN8, at least one of the conditions 1-3 below is met:

-   -   condition 1: N8 is A or G;    -   condition 2: N7 is C; and    -   condition 3: N6 is A, C or G.

Embodiment 23

The method according to any of embodiments 1-22, wherein the sgASO is anoligonucleotide consisting of any one sequence from SEQ ID NO.: 1 to SEQID NO.: 16384.

Embodiment 24

A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of adisease or disorder in a patient, comprising an oligonucleotide of about7 mers, wherein the oligonucleotide of about 7 mers is complementary tothe target RNA associated with the disease or disorder, the target RNAcan form at least one stem-loop structure, the oligonucleotide of about7 mers can hybridize to the 3′ side region of the stem loop structure toform at least one larger stem loop structure in conjunction with thestem loop formed by the target RNA, and wherein the formed structuresare recognized by tRNaseZ^(L) in the patient's body and the target mRNAis cleaved.

Embodiment 25

A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of acancer, which comprising a sgASO comprising any of the sequencesselected from:

5′-GAAACUU-3′; 5′-CUGUCAA-3′; 5′-UCUUCAA-3′; 5′-UUAUCGU-3′;5′-CUUAUAA-3′; 5′-GCGGGGG-3′; and 5′-ACUCAAA-3′.

Embodiment 26

A method for designing an oligonucleotide (sgASO) to cleave a target RNAin a eukaryotic cell, comprising:

-   -   i) identifying a sequence in the target RNA sequence in which at        least one stem-loop structure is formed,    -   ii) identifying a sequence of 6 to 10 bases on the 3′ terminal        adjacent to the stem-loop structure as a sgASO-binding sequence,        and    -   iii) identifying a sequence complementary to the binding        sequence as a sgASO sequence.

Embodiment 27

The method for designing an oligonucleotide (sgASO) according toembodiment 25, wherein

-   -   i) the number of base pairs in the stem portion of the stem-loop        structure formed by the target RNA is 4 to 8;    -   ii) the number of bases in the loop portion of the stem-loop        structure is 3 to 10;    -   iii) in the case where the stem portion of the stem-loop        structure contains a mismatch or bulges, in the counting of the        number of base pairs in the stem portion, when the number of        base pairs in the mismatch or bulges of the stem is 2 or less,        the mismatch or bulges is considered to form a base pair and        counted; and when the number of base pairs in the mismatch or        bulges of the stem is 3 or more, half of the number of bases in        the mismatch or bulges is counted as base pairs; and    -   iv) the difference in the number of bases between the        5′-terminal sequence and 3′-terminal sequence of the stem        portion is 1 or less.

Embodiment 28

The method according to embodiment 27, wherein when the basesconstituting the sgASO-bound region on the target RNA from the 5′terminal are N1, N2, N3, N4, N5, N6 and N7, and further the first baseadjacent to the 3′ terminal of the region to which the sgASO binds isN8, at least one of the conditions 1-3 below is met:

-   -   condition 1: N8 is A or G;    -   condition 2: N7 is C; and    -   condition 3: N6 is A, C or G.

Embodiment 29

A method of designing a small guide antisense oligonucleotide (sgASO),comprising

-   -   (1) identifying a stem loop with a high existence probability on        the target RNA,    -   (2) evaluating the stem loop, and    -   (3) setting the seven bases sequence complimentary to 3′        terminal sequence to the stem loop-forming base pair as the        target sequence (sense strand) and identifying its antisense        strand to be a sgASO sequence, wherein the step of (1)        identifying a stem loop with a high existence probability on the        target RNA comprises:    -   i) a step of predicting structure, comprising setting frame n        having the width of W bases by an increment of R bases starting        from the 5′ terminal, wherein the number of the resulting frames        is nmax, computing the base-pair pattern which can be obtained        by pattern matching for the constituent base sequence of the W        bases in each frame n, applying known thermodynamic stability        calculations to the result, and giving ΔG for each base-pair        pattern;    -   ii) a step of analyzing structure, comprising hypothesizing        based on the resulting mmax(n) structures predicted in frame n        and respective energy level, that the state inside the cell        within which the RNA is placed is in equilibrium, calculating        the existence probability of each resulting predicted structure        according to the Maxwell-Boltzmann statistics, wherein the        existence probability of each predicted structure result is        j(n, m) for the mth predicted result from the most stable        structure among the resulting predicted structures in frame n;    -   iii) a step of calculating local existence probability,        comprising setting p as a property profile of a loop and stem        (characteristics of the stem loop defined by the position of        base in the stem-constituting base pair) formed beginning from        the absolute position x on the sequence rather than in the        frame, and defining the stem-loop as motif(x, p), and defining        the existence probability in frame n of the motif(x, p) as        partial existence probability P_local(x, p, n), and calculating        the value as sum Σj(n, m) of the j values for the prediction        results of structures in which the stem loop exists among all        the resulting predicted structures obtained in the frame n,        wherein the local existence probability P_local(x, p, n) of        motif(x, p) in the frame n is represented below:

${{P\_ local}\left( {x,p,n} \right)} = {\sum\limits_{m = 1}^{{mmax}{(n)}}\left\{ \begin{matrix}0 & {\mspace{14mu} \begin{matrix}{\ldots \mspace{14mu} {if}\mspace{14mu} {motif}\mspace{14mu} \left( {x,p} \right)\mspace{14mu} {is}\mspace{14mu} {not}\mspace{14mu} {found}\mspace{14mu} {in}\mspace{14mu} {the}} \\{m\text{-}{th}\mspace{14mu} {structure}\mspace{14mu} {of}\mspace{14mu} {frame}\mspace{14mu} n}\end{matrix}} \\{j\left( {n,m} \right)} & {\mspace{11mu} \begin{matrix}{\ldots \mspace{14mu} {if}\mspace{14mu} {motif}\mspace{14mu} \left( {x,p} \right)\mspace{14mu} {is}\mspace{14mu} {found}\mspace{14mu} {in}\mspace{14mu} {the}} \\{m\text{-}{th}\mspace{14mu} {structure}\mspace{14mu} {of}\mspace{14mu} {frame}\mspace{14mu} n}\end{matrix}\;}\end{matrix} \right.}$

-   -   iv) a step of calculating existence probability, comprising        giving the existence probability P_global(x, p) of motif(x, p)        among the entirety as ΣP_local(x, p, n)/n_all(x, p) when        NP_local(x, p, n) is the result of sum of P_local(x, p, n) from        frame 1 to nmax, and the number of frames in which the full        length of the sequence constituting the stem-loop is contained        within the frame is n_all(x, p), wherein the existence        probability of motif(x, p) among the entirety is represented as        below, and

${{{P\_}{global}}\left( {x,p} \right)} = {\sum\limits_{n = 1}^{nmax}\frac{{P\_ local}\left( {x,p,n} \right)}{n\_ all}}$

-   -   v) a step of analyzing, comprising selecting a stem-loop based        on the existence probability and property p, with respect to the        obtained existence probability P_global(x, p) of motif(x, p).

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

FIG. 1 is a graphical representation of the result of testing theinhibition of Bcl-2 mRNA expression by the sgASO (VIS-1 to VIS-7)designed according to the present invention using the human leukemiccell line HL60. As a result, VIS-1 and VIS-5 were obtained as sgASO witha 2-fold activity relative to that of a previously reported sgASO, Hepi.The vertical axis shows the relative Bcl-2 mRNA levels with mock (samplewith only water as medium) set as 1.

MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

The present inventors have developed a method for efficiently regulatinggene expression in cells using relatively short oligonucleotides. Thepresent invention is described in detail below.

TRUE Gene Silencing The inventors of the present invention havedeveloped a new gene expression repression technology named TRUE genesilencing (tRNase Z^(L)-utilizing efficacious gene silencing). tRNaseZ^(L) is a large molecular-weight type enzyme of endoribonuclease(tRNase Z or 3′ tRNase) that processes the 3′ end portion of tRNA, andit excises the 3′ end portion of the precursor tRNA. This TRUE genesilencing is based on the unique enzymatic properties of mammaliantRNase Z^(L) that any RNA can be cleaved at any point by recognizingpre-tRNA- or micro-pre-tRNA-like complexes formed by target RNAs andsynthetic small guide antisense nucleic acids. Small guide antisenseoligonucleotides (in particular, small guide RNAs) are categorized intofour types: 5′-half tRNA (Nashimoto, M. (1996) Specific cleavage oftarget RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processingendoribonuclease. RNA, 2, 2523-2524), 12-16 nt linear RNA (Shibata, H.S., Takaku, H., Takagi, M. and Nashimoto, M. (2005) The T loopsstructure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J.Biol. Chem., 280, 22326-22334), heptameric RNA (Nashimoto, M., Geary,S., Tamura, M. and Kasper, R. (1998) RNA heptamers that directs RNAcleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic AcidsRes., 26, 2565-2571), and hook-type RNA (Takaku, H., Minagawa, A.,Takagi, M. and Nashimoto, M. (2004) A novel four-base-recognizing RNAcutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNAmolecules. Nucleic Acids Res., 32, e91).

Previously, the efficacy of TRUE gene silencing in various mammaliancells has been demonstrated by introducing expression plasmids of smallguide antisense oligonucleotides (sgASO) targeting various mRNAs or2′-O-methylated RNAs. For example, the HIV-1 expression in Jurkat cellswas suppressed by 5′ half tRNA-type sgRNA for more than 18 days (Habu etal. (2005) above), and the luciferase expression in mouse liver wassuppressed by heptamer-type sgASO (Nakashima et al. (2007) above).Moreover, the effects of TRUE gene silencing are comparable to those ofRNA interference (RNA interference: RNAi), and in some cases have alsobeen confirmed to outweigh the effects of RNAi.

It has been found that tRNase Z^(L) is present not only in the nucleusbut also in the cytosol, and that the same 5′-half tRNA used as sgASO ispresent in the cytosol. It has also been found that human cytosolictRNase Z^(L) regulates gene expression by cleaving mRNA under theguidance of 5′-half tRNA and that PPM1F mRNA is one of the bona fidetargets of tRNase Z^(L)(Elbarbary, R. A., Takaku, H., Uchiumi, N.,Tamiya, H., Abe, M., Takahashi, M., Nishida, H. and Nashimoto, M. (2009)Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through5′-half-tRNA. PLoS ONE, 4, e5908). Moreover, it has been proved that aportion of microRNAs including miR-103 can act as a hook-type sgASO anddown-regulate gene expression through mRNA cleavage by cytosolic tRNaseZ^(L) (Elbarbary, R. A., Takaku, H., Uchiumi, N., Tamiya, H., Abe, M.,Nishida, H. and Nashimoto, M. (2009) Human cytosolic tRNase ZL candownregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246).Thus, it is clear that TRUE gene silencing functions on the basis of thenewly elucidated physiological roles of cytosolic tRNase Z^(L) operatedby small non-coding RNAs in cells.

One of the ultimate purposes of TRUE gene silencing is the use of sgASOas an agent for treating or preventing a disease caused by theexpression of a specific gene. For example, the present inventors havepreviously found that the intracellular levels of mRNAs encoding Bcl-2and VEGF, which have shown promise as molecular targets for cancertherapy, are suppressed by 5′-type half tRNA type sgASO, 14-nt linearsgASO or heptamer-type sgASO (Tamura et al. (2003) and Elbarbary et al.(2009) above). One embodiment of the present invention relates to amethod for cleaving a target RNA within a eukaryotic cell, comprising:(1) identifying in the target RNA sequence a sequence in which at leastone stem-loop structure is formed by hybridization of a 6mer to 10meroligonucleotide (sgASO) complementary to the target RNA, and (2)preparing the sgASO and contacting it with the target RNA in aeukaryotic cell, wherein tRNaseZ^(L) in the eukaryotic cell recognizesthe stem-loop structure formed by sgASO hybridization and cleaves thetarget RNA. The method can be applied both in vitro and in vivo. Whenapplied in vivo to humans or non-human animals, such methods forcleaving target RNAs within eukaryotic cells may be used for thetreatment of diseases or disorders related to the expression ofundesirable genes. Thus, from another perspective, one of theembodiments of the present invention relates to a method for treating adisease or disorder related to the expression of a undesirable gene in ahuman or a non-human animal, comprising (1) identifying a sequence inthe target RNA sequence in which at least one stem-loop structure isformed by hybridization of a 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO)complementary to a target RNA transcribed from a disease-related gene,and (2) preparing the sgASO and administering it to a human or anon-human animal to contact it with the target RNA in the cell, whereintRNaseZ^(L) in the cell recognizes the stem-loop structure formed bysgASO hybridization and cleaves the target RNA. The disease of interestcan be, for example, cancer.

Small Guide Antisense Nucleic Acid (sgASO).

In one embodiment, the small guide antisense nucleic acid is arelatively short oligonucleotide, for example, 6-mer to 10-mer, i.e.,6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, or 10-mer, preferably 7-mer oligonucleotide(heptamer-type sgASO). When sgASO is used as a pharmaceuticalingredient, a shorter sgASO is preferred from the pharmacological andCMC (Chemistry, Manufacturing and Control) perspectives. The reason isthat a shorter sgASO can be synthesized more conveniently and lessexpensively than a long chain sgASO. Also, shorter sgASO can be easilyinternalized into cells without the use of cell transfection agents(transfection reagents, etc.) and DDS bases (Loke, S. L., Stein, C. A.,Zhang X. H., Mori, K., Nakanishi, M., Subasinghe, C., Cohen, J. S. andNeckers, L. M. (1989) Characterization of oligonucleotide transport intoliving cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3474-3478). In practicalapplications, 7-mer oligonucleotides may be preferred in terms of theadvantage in synthesis and from the perspective of sequence recognitionspecificity.

The sgASO may be prepared by methods using known chemical syntheses,enzymatic transcription methods, or such. Methods using known chemicalsyntheses can include phosphoroamidite method, phosphorothioate method,phosphotriester method, and such; and synthesis can be done in ABI3900high-throughput nucleic acid synthesizers (manufactured by AppliedBiosystems, Inc.), NTS H-6 nucleic acid synthesizers (manufactured byNippon Technology Services), and Oligoilot10 nucleic acid synthesizers(manufactured by GE Healthcare Inc.). Enzymatic transcription methodscan include transcription using RNA polymerases such as T7, T3, andSP6RNA polymerases, and plasmids or DNAs with the sequence of interestas template. Heptamer-type sgASO produced by synthetic ortranscriptional methods are then purified by HPLC and such. For example,at the time of HPLC purification, sgASO is eluted from the columns usinga mixed solution of triethylammonium acetate (TEAA) or hexylammoniumacetate (HAA) and acetonitrile. After the eluted solution is dialyzedwith 1000 times the eluted volume of distilled water for 10 hours andthe dialysis solution is lyophilized, it is cryopreserved until use. Atthe time of use, it is dissolved in distilled water, for example, sothat the final concentration becomes about 100 μM.

The nucleic acids used in the sgASO of the present invention may be anynucleosides or molecules whose function is equivalent to thenucleosides, which are polymerized via inter-nucleoside bonds.Nucleosides are a class of compounds in which bases (nucleobases) andsugars are attached. Bases include purine bases such as adenine andguanine, pyrimidine bases such as thymine, cytosine and uracil, andnicotinamide and dimethylisoalloxazine. Adenosine, thymidine, guanosine,cytidine, uridine and such are representative nucleosides. A nucleotideis a substance in which a phosphate group is attached to a nucleoside.Oligonucleotides (also called polynucleotides) include, for example, RNAribonucleotide polymers, DNA deoxyribonucleotide polymers, polymers ofmixed RNA and DNA, and nucleotide polymers containing modifiednucleosides. Natural DNA and RNA have phosphodiester bonds asinternucleoside bonds. The nucleic acids used for the sgASO in thepresent invention may include modifications. The location of nucleicacid modifications includes sugar moieties, backbone (ligation)moieties, nucleobase (base) moieties, and 3′ or 5′ end moieties. Also,the sgASO used in the present invention may include a morpholino nucleicacid or a peptide nucleic acid.

Modified Nucleosides

Modified nucleosides can include molecules that have been modified toribonucleosides, deoxyribonucleosides, RNA or DNA to enhance orstabilize nuclease resistance, to enhance affinity with complementarystrand nucleic acids, to increase cell permeability, or to bevisualized, for example, in comparison with RNA or DNA. Examples includesugar-modified nucleosides. The sgASO of the present invention mayinclude, for example, modified nucleic acid molecules disclosed inKhvorova & Watts (Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017)doi:10.1038/nbt.3765).

Modified sugars refer to sugars with substitutions and/or any changesfrom natural sugar moieties (i.e., sugar moieties found in DNA (2′-H) orRNA (2′-OH)), whereas sugar-modified nucleosides refer to modifiednucleosides containing modified sugars. Sugar-modified nucleosides canbe any nucleosides whose sugar chemical structure is partially orentirely modified by addition of or substitution with any arbitrarychemical structure substance, for example, modified nucleosides bysubstitution with 2′-O-methylribose, modified nucleosides bysubstitution with 2′-methoxyethoxyribose, modified nucleosides bysubstitution with 2′-O-methoxyethylribose, modified nucleosides bysubstitution with 2′-O-[2-(guanidium)ethyl]ribose, modified nucleosidesby substitution with 2′-O-fluororibose, bridged structure-typeartificial nucleic acids (Bridged Nucleic Acid) with two cyclicstructures (BNA) by introduction of a cross-linking structure into thesugar moiety, more specifically, locked artificial nucleic acids (LockedNucleic Acid: LNA) with oxygen atoms at the 2′ position and carbon atomsat the 4′ position being cross-linked via methylene, ethylene bridgedstructure-type nucleic acids (Ethylene bridged nucleic acid: ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)] and such; and may furtherinclude peptide nucleic acids (PNAs) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)],oxypeptide nucleic acids (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)],and peptide ribonucleic acids (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)].

RNA 2′-O-methyl (2′-OMe) modification (2′-OMe-RNA) is a naturallyoccurring modification that improves the binding affinity and nucleaseresistance of modified oligonucleotides, as well as reducesimmunostimulatory properties. 2′-O-Methoxyethyl (2′-MOE) increases thenuclease resistance more than the 2′-OMe modification, and the bindingaffinity (ΔTm) of the modified nucleotides is also greatly elevated. ThesgASO containing 2′-OMe is also compatible with recognition and cleavageby tRNaseZ^(L). The 2′-fluoro (2′-F) modification of RNA (2′-F-RNA) canalso be used to increase the affinity of oligonucleotides. Other2′-modified nucleic acids may include 2′-F-ANA and 2′-modifiedderivatives of Kane et al. (Japanese Patent No. 5194256, Japanese PatentApplication Kokai Publication No. (JP-A) 2015-020994 (unexamined,published Japanese patent application)).

LNA (Locked nucleic acid), which links the 2′ oxygen and 4′ carbon ofribose, leads to substantial increases in binding affinity. In LNA, the2′ oxygen and 4′ carbon of the RNA ribose sugar are anchored in the ringstructure. This modification increases specificity, affinity, andhalf-life, allowing effective delivery to the tissue of interest withlower toxicity. It is known that there is a tendency for oligomerslonger than 8 nucleotides that have been fully modified with LNA toaggregate, and it is commonly used in mixture with DNA and othersugar-modified nucleic acids. LNA-containing sgASO is also compatiblewith recognition and cleavage by tRNaseZ^(L).

A methylation analog of LNA, cEt, is as useful as LNA. Tricyclo-DNA(tcDNA) is a restricted form of nucleotides based on the three-ringscaffold.

As modified nucleosides, in addition, those with atoms (e.g., hydrogenatoms, oxygen atoms) or functional groups (e.g., hydroxyl groups, aminogroups) in the base moiety of a nucleic acid being substituted withother atoms (e.g., hydrogen atoms, sulfur atoms), functional groups(e.g., amino groups), or alkyl groups of carbon numbers 1-6, orprotected with protecting groups (e.g., methyl or acyl groups); andnucleosides added with phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine,anthraquinone, acridine, fluorescein, rhodamine, coumarin, dye, oranother chemical substance may be used.

Modified nucleobases (or modified bases) include any nucleobases otherthan adenine, cytosine, guanine, thymine, and uracil, for example,5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-iodocytosine,N4-methylcytosine, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-iodouracil,2-thiothymine, N6-methyladenine, 8-bromoadenine, N2-methylguanine,8-bromoguanine, and inosine.

Internucleoside Linkages

Natural DNA and RNA have phosphodiester bonds as internucleoside bonds.In one embodiment of the present invention, the internucleoside linkagemay comprise a modification. Modified internucleoside linkages refer tointernucleoside linkages with substitutions or any change from naturallyoccurring internucleoside linkages (i.e., phosphodiester linkages); andmodified internucleoside linkages include internucleoside linkagescontaining phosphorus atoms, and internucleoside linkages withoutphosphorus atoms. Modified nucleoside-to-nucleoside bonds may be thosein which the chemical structure of a nucleotide's phosphate diester bondis partially or entirely added or substituted with any arbitrarychemical substance, for example, modified internucleoside bonds bysubstitution with phosphorothioate bonds, modified internucleoside bondsby substitution with N3′-P5′ phosphoamidate bonds, and such. Othermodified internucleoside linkages include (S_(C5′)R)-α, β-CNA, and PMOs.

Representative phosphorus-containing internucleoside bonds are, forexample, phosphodiester bonds, phosphorothioate bonds,phosphorodithioate bonds, phosphotriester bonds, and methylphosphonatebonds, methylthiophosphonate bonds, boranophosphate bonds,phosphoroamidate bonds, and such.

Phosphorothioate (PS) linkage, which is one of the major modifiedinternucleoside linkages, serves to protect oligonucleotides fromdegradation by nucleases. The phosphorodithioate (PS) modification wasoriginally incorporated into the oligonucleotide to confer nucleaseresistance, but this modification also greatly influencesoligonucleotide transportation and uptake. PS enhances binding toreceptor sites and plasma proteins by altering the charge of ASOs,increasing the amount of ASOs that reach target tissues. Heparin-bindingproteins are among the highest affinity targets ofphosphorothioate-modified oligonucleotides.

Proper binding by plasma proteins suppresses rapid elimination from theblood by the kidney system and facilitates optimal delivery. A sgASOwith a phosphothioate bond is also compatible with recognition andcleavage by tRNaseZ^(L).

Phosphorothioate bonds have a stereocenter in phosphorus atomicmoieties, and fully modified oligonucleotides usually form a mixture ofdiastereomers of 2^(n−1) species (e.g., 7-mer phosphorothioateoligonucleotides form a mixture of 2⁶ species of diastereomers). S_(p)and R_(p) diastereomeric binding are known to exhibit distinctproperties. R_(p) diastereomers are less nuclease resistant than S_(p)diastereomers, but they bind complementary strands with higheraffinities. In the sgASO of the present invention, synthesis may beregulated so that a particular phosphorothioate bond becomes aparticular diastereomer.

Ligand-Linked Oligonucleotides/Terminally Modified Oligonucleotides

Molecules in which another chemical substance is added to a nucleic acidare, for example, 5′-polyamine-conjugated derivatives,cholesterol-conjugated derivatives, corticosteroid-conjugatedderivatives, bile acid-conjugated derivatives, vitamin-conjugatedderivatives, Cy5-conjugated derivatives, Cy3-conjugated derivatives,6-FAM-conjugated derivatives, biotin-conjugated derivatives, Kitaeji'sderivatives (PCT/JP2007/000087, PCT/JP2016/59398) and such. Sites atwhich a ligand or such is added may be terminus of an oligonucleotide(5′ end or 3′ end) and/or within an oligonucleotide.

As examples of terminal modifications, GalNAc-linked oligonucleotidesand PUFA-linked oligonucleotides are known. Ligating GalNAc to the endof an oligonucleotide can enhance its delivery efficiency to the liver.The sgASO used in the present invention may be linked to a ligand suchas GalNAc.

Short oligonucleotides are more likely to be delivered to the kidney,and long oligomers are more likely to be delivered to the liver. Shortoligonucleotides tend to bind poorly to plasma proteins, resulting in ashorter half-life in plasma, but multimers can be constructed usingcleavable linkers or such. The sgASO used in the present invention maybe linked to another sgASO using a cleavable linker or such.

A phosphate group may be added to the 5′ end and/or 3′ end of the sgASOin the present invention. Other terminal modifications include E-VP,methylphosphonates, phosphorothioates, and C-methyl analogs, which areknown to enhance the stability of oligonucleotides. The sgASO used inthe present invention may include these terminal modifications.

SgASO Sequence Design

In order for the sgASO in the present invention to enable specificcleavage of the target RNA by tRNase Z^(L) through formation of a tRNAacceptor stem-like duplex with the target RNA via base pairing, thetarget site of the sgASO is directly below a stable hairpin structuralregion similar to the tRNA T arm. SgASO effectively cleaves RNA not onlywith its seven bases, but also by specificity of the sequence regionthat forms a stable hairpin structure. Therefore, the sgASO sequence canbe designed based on the mRNA sequence data of the target gene.

One embodiment of the present invention relates to a method for cleavinga target RNA in a eukaryotic cell, comprising: (1) identifying in thetarget RNA sequence at least one stem-loop structure formed byhybridizing a 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) complementary tothe target RNA, and (2) preparing the sgASO and contacting it with thetarget RNA in a eukaryotic cell, wherein tRNaseZ^(L) in the eukaryoticcell recognizes the stem-loop structure formed by sgASO hybridization tocleave the target RNA.

Conformationally, the acceptor stem and T arm of the tRNA adopt a singlestem-loop structure in tandem, and tRNase ZL is thought to recognizethis stem-loop conformation and perform RNA cleavage. Thus,hybridization of the sgASO with a target RNA allows cleavage of thetarget RNA if it reproduces a single stem-loop structure similar to thestructure formed by the acceptor stem and T arm.

For example, for human glutamate tRNA, the acceptor stem is 7 baseslong, the stem portion of T arm is 5 bases long, and the loop portion ofT arm is 7 bases long. Thus, the sgASO corresponding to the acceptorstem may be, for example, 7 bases long, but it is not necessarilylimited thereto. The length of the sgASO may be, for example, 6-10 mers.Also, the T-arm-like stem-loop structure formed by the target RNA may befive bases long in the stem portion and seven bases in the loop portion,but it is not necessarily limited thereto. The length of the stemportion of the T-arm-like stem-loop structure formed by the target RNAmay be, for example, 4-8 bases long. The number of bases in the loopportion can be, for example, 3-10 bases, preferably 4-8 bases. Moreover,the length of the sgASO and the length of the stem portion in theT-arm-like stem-loop structure formed by the target RNA can be a lengthof 12 bases in sum, but it is not necessarily limited thereto. The sumof the lengths can be, for example, 11-14 bases. However, in realapplications, it may be preferable that the sgASO is a 7-meroligonucleotide in terms of the advantage in synthesis and from theperspective of sequence recognition specificity. For the T-arm-likestem-loop structure formed by target RNA, it may be preferable to have astem portion length of 5 bases in terms of stability and existenceprobability. From a similar point of view, for a T-arm-like stem-loopstructure formed by target RNA, it may be preferable that the twostrands of the stem portion have equal lengths (within one difference inthe number of bases between the stem's 5′ side sequence and 3′ sidesequence flanking the loop) and that the length of the loop portion doesnot exceed 10.

In designing the sgASO sequence, based on the results of the sequencinganalysis of the tRNA gene performed by the present inventors, the basesconstituting the sgASO-bound region on the target RNA from the 5′ sideare defined as N1, N2, N3, N4, N5, N6 and N7, and further the first baseadjacent to the 3′ side of the region to which the sgASO binds isdefined as N8. The sequence may be designed to satisfy at least one ofthe conditions 1 to 3 below, or the sequence may be designed to satisfyat least two of the conditions 1 to 3 or all of the conditions 1 to 3:

-   -   condition 1: N8 is A or G;    -   condition 2: N7 is C; and    -   condition 3: N6 is A, C or G.

The T-arm-like stem-loop structure formed by the target RNA and/or theacceptor stem-like structure formed by the target RNA and the sgASO mayinclude non-Watson-Crick base pairs besides Watson-Crick base pairs(e.g., G-U bonds). The stem may also contain a mismatch or bulge.

If the sgASO is a 7-mer, the sgASO may be an oligonucleotide consistingof any one sequence from Sequence Number 1 to Sequence Number 16384. Inaddition, the term “Sequence Number n” may be referred to as “SEQ ID NO:n” in the present specification. Sequences from SEQ ID NO: 1 to SEQ IDNO: 16384 are shown in the table below.

TABLE 2 SEQ ID NO: 307 AACAUAG SEQ ID NO: 358 AACCGCC SEQ ID NO: 409AACGCGA SEQ ID NO: 460 AACUAGU SEQ ID NO: 511 AACUUUG SEQ ID NO: 562AAGAUAC SEQ ID NO: 308 AACAUAU SEQ ID NO: 359 AACCGCG SEQ ID NO: 410AACGCGC SEQ ID NO: 461 AACUAUA SEQ ID NO: 512 AACUUUU SEQ ID NO: 563AAGAUAG SEQ ID NO: 309 AACAUCA SEQ ID NO: 360 AACCGCU SEQ ID NO: 411AACGCGG SEQ ID NO: 462 AACUAUC SEQ ID NO: 513 AAGAAAA SEQ ID NO: 564AAGAUAU SEQ ID NO: 310 AACAUCC SEQ ID NO: 361 AACCGGA SEQ ID NO: 412AACGCGU SEQ ID NO: 463 AACUAUG SEQ ID NO: 514 AAGAAAC SEQ ID NO: 565AAGAUCA SEQ ID NO: 311 AACAUCG SEQ ID NO: 362 AACCGGC SEQ ID NO: 413AACGCUA SEQ ID NO: 464 AACUAUU SEQ ID NO: 515 AAGAAAG SEQ ID NO: 566AAGAUCC SEQ ID NO: 312 AACAUCU SEQ ID NO: 363 AACCGGG SEQ ID NO: 414AACGCUC SEQ ID NO: 465 AACUCAA SEQ ID NO: 516 AAGAAAU SEQ ID NO: 567AAGAUCG SEQ ID NO: 313 AACAUGA SEQ ID NO: 364 AACCGGU SEQ ID NO: 415AACGCUG SEQ ID NO: 466 AACUCAC SEQ ID NO: 517 AAGAACA SEQ ID NO: 568AAGAUCU SEQ ID NO: 314 AACAUGC SEQ ID NO: 365 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TABLE 13 SEQ ID NO: 3673 AUGCCGA SEQ ID NO: 3724 AUGGAGU SEQ ID NO: 3775AUGGUUG SEQ ID NO: 3826 AUGUUAC SEQ ID NO: 3877 AUUAGCA SEQ ID NO: 3928AUUCCCU SEQ ID NO: 3674 AUGCCGC SEQ ID NO: 3725 AUGGAUA SEQ ID NO: 3776AUGGUUU SEQ ID NO: 3827 AUGUUAG SEQ ID NO: 3878 AUUAGCC SEQ ID NO: 3929AUUCCGA SEQ ID NO: 3675 AUGCCGG SEQ ID NO: 3726 AUGGAUC SEQ ID NO: 3777AUGUAAA SEQ ID NO: 3828 AUGUUAU SEQ ID NO: 3879 AUUAGCG SEQ ID NO: 3930AUUCCGC SEQ ID NO: 3676 AUGCCGU SEQ ID NO: 3727 AUGGAUG SEQ ID NO: 3778AUGUAAC SEQ ID NO: 3829 AUGUUCA SEQ ID NO: 3880 AUUAGCU SEQ ID NO: 3931AUUCCGG SEQ ID NO: 3677 AUGCCUA SEQ ID NO: 3728 AUGGAUU SEQ ID NO: 3779AUGUAAG SEQ ID NO: 3830 AUGUUCC SEQ ID NO: 3881 AUUAGGA SEQ ID NO: 3932AUUCCGU SEQ ID NO: 3678 AUGCCUC SEQ ID NO: 3729 AUGGCAA SEQ ID NO: 3780AUGUAAU SEQ ID NO: 3831 AUGUUCG SEQ ID NO: 3882 AUUAGGC SEQ ID NO: 3933AUUCCUA SEQ ID NO: 3679 AUGCCUG SEQ ID NO: 3730 AUGGCAC SEQ ID NO: 3781AUGUACA SEQ ID NO: 3832 AUGUUCU SEQ ID NO: 3883 AUUAGGG 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TABLE 27 SEQ ID NO: 7957 CUUACCA SEQ ID NO: 8008 CUUCACU SEQ ID NO: 8059CUUCUGG SEQ ID NO: 8110 CUUGGUC SEQ ID NO: 8161 CUUUGAA SEQ ID NO: 8212GAAACAU SEQ ID NO: 7958 CUUACCC SEQ ID NO: 8009 CUUCAGA SEQ ID NO: 8060CUUCUGU SEQ ID NO: 8111 CUUGGUG SEQ ID NO: 8162 CUUUGAC SEQ ID NO: 8213GAAACCA SEQ ID NO: 7959 CUUACCG SEQ ID NO: 8010 CUUCAGC SEQ ID NO: 8061CUUCUUA SEQ ID NO: 8112 CUUGGUU SEQ ID NO: 8163 CUUUGAG SEQ ID NO: 8214GAAACCC SEQ ID NO: 7960 CUUACCU SEQ ID NO: 8011 CUUCAGG SEQ ID NO: 8062CUUCUUC SEQ ID NO: 8113 CUUGUAA SEQ ID NO: 8164 CUUUGAU SEQ ID NO: 8215GAAACCG SEQ ID NO: 7961 CUUACGA SEQ ID NO: 8012 CUUCAGU SEQ ID NO: 8063CUUCUUG SEQ ID NO: 8114 CUUGUAC SEQ ID NO: 8165 CUUUGCA SEQ ID NO: 8216GAAACCU SEQ ID NO: 7962 CUUACGC SEQ ID NO: 8013 CUUCAUA SEQ ID NO: 8064CUUCUUU SEQ ID NO: 8115 CUUGUAG SEQ ID NO: 8166 CUUUGCC SEQ ID NO: 8217GAAACGA SEQ ID NO: 7963 CUUACGG SEQ ID NO: 8014 CUUCAUC SEQ ID NO: 8065CUUGAAA SEQ ID NO: 8116 CUUGUAU SEQ ID NO: 8167 CUUUGCG 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TABLE 54 SEQ ID NO: 16219 UUUCCGG SEQ ID NO: 16220 UUUCCGUSEQ ID NO: 16221 UUUCCUA SEQ ID NO: 16222 UUUCCUC SEQ ID NO: 16223UUUCCUG SEQ ID NO: 16224 UUUCCUU SEQ ID NO: 16225 UUUCGAASEQ ID NO: 16226 UUUCGAC SEQ ID NO: 16227 UUUCGAG SEQ ID NO: 16228UUUCGAU SEQ ID NO: 16229 UUUCGCA SEQ ID NO: 16230 UUUCGCCSEQ ID NO: 16231 UUUCGCG SEQ ID NO: 16232 UUUCGCU SEQ ID NO: 16233UUUCGGA SEQ ID NO: 16234 UUUCGGC SEQ ID NO: 16235 UUUCGGGSEQ ID NO: 16236 UUUCGGU SEQ ID NO: 16237 UUUCGUA SEQ ID NO: 16238UUUCGUC SEQ ID NO: 16239 UUUCGUG SEQ ID NO: 16240 UUUCGUUSEQ ID NO: 16241 UUUCUAA SEQ ID NO: 16242 UUUCUAC SEQ ID NO: 16243UUUCUAG SEQ ID NO: 16244 UUUCUAU SEQ ID NO: 16245 UUUCUCASEQ ID NO: 16246 UUUCUCC SEQ ID NO: 16247 UUUCUCG SEQ ID NO: 16248UUUCUCU SEQ ID NO: 16249 UUUCUGA SEQ ID NO: 16250 UUUCUGCSEQ ID NO: 16251 UUUCUGG SEQ ID NO: 16252 UUUCUGU SEQ ID NO: 16253UUUCUUA SEQ ID NO: 16254 UUUCUUC SEQ ID NO: 16255 UUUCUUGSEQ ID NO: 16256 UUUCUUU SEQ ID NO: 16257 UUUGAAA SEQ ID NO: 16258UUUGAAC SEQ ID NO: 16259 UUUGAAG SEQ ID NO: 16260 UUUGAAUSEQ ID NO: 16261 UUUGACA SEQ ID NO: 16262 UUUGACC SEQ ID NO: 16263UUUGACG SEQ ID NO: 16264 UUUGACU SEQ ID NO: 16265 UUUGAGASEQ ID NO: 16266 UUUGAGC SEQ ID NO: 16267 UUUGAGG SEQ ID NO: 16268UUUGAGU SEQ ID NO: 16269 UUUGAUA SEQ ID NO: 16270 UUUGAUCSEQ ID NO: 16271 UUUGAUG SEQ ID NO: 16272 UUUGAUU SEQ ID NO: 16273UUUGCAA SEQ ID NO: 16274 UUUGCAC SEQ ID NO: 16275 UUUGCAGSEQ ID NO: 16276 UUUGCAU SEQ ID NO: 16277 UUUGCCA SEQ ID NO: 16278UUUGCCC SEQ ID NO: 16279 UUUGCCG SEQ ID NO: 16280 UUUGCCUSEQ ID NO: 16281 UUUGCGA SEQ ID NO: 16282 UUUGCGC SEQ ID NO: 16283UUUGCGG SEQ ID NO: 16284 UUUGCGU SEQ ID NO: 16285 UUUGCUASEQ ID NO: 16286 UUUGCUC SEQ ID NO: 16287 UUUGCUG SEQ ID NO: 16288UUUGCUU SEQ ID NO: 16289 UUUGGAA SEQ ID NO: 16290 UUUGGACSEQ ID NO: 16291 UUUGGAG SEQ ID NO: 16292 UUUGGAU SEQ ID NO: 16293UUUGGCA SEQ ID NO: 16294 UUUGGCC SEQ ID NO: 16295 UUUGGCGSEQ ID NO: 16296 UUUGGCU SEQ ID NO: 16297 UUUGGGA SEQ ID NO: 16298UUUGGGC SEQ ID NO: 16299 UUUGGGG SEQ ID NO: 16300 UUUGGGUSEQ ID NO: 16301 UUUGGUA SEQ ID NO: 16302 UUUGGUC SEQ ID NO: 16303UUUGGUG SEQ ID NO: 16304 UUUGGUU SEQ ID NO: 16305 UUUGUAASEQ ID NO: 16306 UUUGUAC SEQ ID NO: 16307 UUUGUAG SEQ ID NO: 16308UUUGUAU SEQ ID NO: 16309 UUUGUCA SEQ ID NO: 16310 UUUGUCCSEQ ID NO: 16311 UUUGUCG SEQ ID NO: 16312 UUUGUCU SEQ ID NO: 16313UUUGUGA SEQ ID NO: 16314 UUUGUGC SEQ ID NO: 16315 UUUGUGGSEQ ID NO: 16316 UUUGUGU SEQ ID NO: 16317 UUUGUUA SEQ ID NO: 16318UUUGUUC SEQ ID NO: 16319 UUUGUUG SEQ ID NO: 16320 UUUGUUUSEQ ID NO: 16321 UUUUAAA SEQ ID NO: 16322 UUUUAAC SEQ ID NO: 16323UUUUAAG SEQ ID NO: 16324 UUUUAAU SEQ ID NO: 16325 UUUUACASEQ ID NO: 16326 UUUUACC SEQ ID NO: 16327 UUUUACG SEQ ID NO: 16328UUUUACU SEQ ID NO: 16329 UUUUAGA SEQ ID NO: 16330 UUUUAGCSEQ ID NO: 16331 UUUUAGG SEQ ID NO: 16332 UUUUAGU SEQ ID NO: 16333UUUUAUA SEQ ID NO: 16334 UUUUAUC SEQ ID NO: 16335 UUUUAUGSEQ ID NO: 16336 UUUUAUU SEQ ID NO: 16337 UUUUCAA SEQ ID NO: 16338UUUUCAC SEQ ID NO: 16339 UUUUCAG SEQ ID NO: 16340 UUUUCAUSEQ ID NO: 16341 UUUUCCA SEQ ID NO: 16342 UUUUCCC SEQ ID NO: 16343UUUUCCG SEQ ID NO: 16344 UUUUCCU SEQ ID NO: 16345 UUUUCGASEQ ID NO: 16346 UUUUCGC SEQ ID NO: 16347 UUUUCGG SEQ ID NO: 16348UUUUCGU SEQ ID NO: 16349 UUUUCUA SEQ ID NO: 16350 UUUUCUCSEQ ID NO: 16351 UUUUCUG SEQ ID NO: 16352 UUUUCUU SEQ ID NO: 16353UUUUGAA SEQ ID NO: 16354 UUUUGAC SEQ ID NO: 16355 UUUUGAGSEQ ID NO: 16356 UUUUGAU SEQ ID NO: 16357 UUUUGCA SEQ ID NO: 16358UUUUGCC SEQ ID NO: 16359 UUUUGCG SEQ ID NO: 16360 UUUUGCUSEQ ID NO: 16361 UUUUGGA SEQ ID NO: 16362 UUUUGGC SEQ ID NO: 16363UUUUGGG SEQ ID NO: 16364 UUUUGGU SEQ ID NO: 16365 UUUUGUASEQ ID NO: 16366 UUUUGUC SEQ ID NO: 16367 UUUUGUG SEQ ID NO: 16368UUUUGUU SEQ ID NO: 16369 UUUUUAA SEQ ID NO: 16370 UUUUUACSEQ ID NO: 16371 UUUUUAG SEQ ID NO: 16372 UUUUUAU SEQ ID NO: 16373UUUUUCA SEQ ID NO: 16374 UUUUUCC SEQ ID NO: 16375 UUUUUCGSEQ ID NO: 16376 UUUUUCU SEQ ID NO: 16377 UUUUUGA SEQ ID NO: 16378UUUUUGC SEQ ID NO: 16379 UUUUUGG SEQ ID NO: 16380 UUUUUGUSEQ ID NO: 16381 UUUUUUA SEQ ID NO: 16382 UUUUUUC SEQ ID NO: 16383UUUUUUG SEQ ID NO: 16384 UUUUUUU

Structural analysis can be performed to identify the T-arm-likestem-loop structure formed by a target RNA in the target RNA, byperforming assessments based on pattern matching and thermodynamicstability. In computations for structural analysis, a working hypothesiscan be put in place that 1) the mRNA adopts a higher-order structure ina single strand on its own without protein involvement, 2) the mRNAadopts a higher-order structure on a fixed-length partial sequence ofthe part presumed to be flanked by ribosomes and ribosomes rather thanon the full-length during protein synthesis by ribosome, and 3) thesingle primary-structure mRNA (or a fixed-length partial sequence aspart thereof) is presumed to adopt multiple higher-order structures andthey are in equilibrium (i.e., the existence probabilities aredistributed according to the amount of energy). Calculation andevaluation of intrinsic partial structures can be based on thishypothesis. In addition, for the designing of sgASO, as tRNase Z^(L) canrecognize a higher-order structure formed by the sgASO and intrinsicstructure, it can be hypothesized that for the intrinsic structure, 1)the loop is 10 bases or less, and 2) the stem is 5 base pairs. Ifstructural analyses based on pattern matching and thermodynamicstability can address all possible structures comprehensively, analysiscan be simplified by calculating only those structures that are likelyto be important using general structure prediction software. Forstructural predictions, software such as vswindow, UNAFold, mfold can beutilized.

For structure prediction, the following references may be referred to:

-   Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic    acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; and-   Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid    folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics,    Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in    Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press,    Totowa, N.J. ISBN 978-1-60327-428-9).

For example, by setting the W-base width frame n from the 5′ end of themRNA in R base increments (nmax frames can be obtained from thetranscript of interest); and in each frame n, it is hypothesized thatthe state within the cell within which the mRNA is placed is inequilibrium based on the predicted structure results and the respectiveenergy levels, and thus the existence probabilities are calculated fromeach predicted structure result by the Maxwell-Boltzmann statistics.Here, for the prediction result of mth from the most stable structureamong the structure prediction results of nth frame (in frame n, thenumber of the predicted structure result obtained is mmax(n)), theexistence probability of that predicted structure can be j(n, m).

Here, defining the partial structure found in each of the structureprediction results, which consists of only one loop site and only onestem complementary to each other, as the stem-loop structure (the term“complementary to each other” for the stem loop does not mean that itdoes not constitute any other stem loop even in other predictionstructure frames, but it means to never include a portion of anotherstem loop in a single prediction structure result). Here, the stem maycontain a mismatch (bases that do not participate in base pairing in thestem are opposing) or a bulge (bases that do not participate in basepairing in the stem are not opposing), but both ends are base pairs. Inaddition, the stem loop enclosed within the stem loop is also consideredas a separate stem loop (e.g., the loosened base pairs farthest from theloop of the stem are treated as separate stem loops from those that arenot loosened).

These stem loops are called motif(x, p) when they begin with theabsolute position x on the sequence rather than in the frame, and theproperty profiles of the constituting loops and stems (individualcharacteristics of the stem loops defined by the position of bases inthe stem-constituting base pairs) are designated as p. Then, theexistence probability within the frame n of motif(x, p) is set aspartial existence probability P_local(x, p, n), and the value is the sumof j values for the structures in which the stem loop exists in thestructure prediction results obtained in the n frame, i.e., Σj(n, m). Inaddition, when the result of summing from frame 1 to nmax for thisP_local(x, p, n) is taken as ΣP_local(x, p, n), and the number of framesin the full-length sequence constituting the stem loop which could fallwithin the frame is set as n_all(x, p), the existence probability ofmotif(x, p) in the whole, P_global(x, p), is represented as ΣP_local(x,p, n)/n_all(x, p).

Namely, in frame n, the local existence probability P_local(x, p, n) ofmotif(x, p) is represented as:

${{P\_ local}\left( {x,p,n} \right)} = {\sum\limits_{m = 1}^{{mmax}{(n)}}\left\{ \begin{matrix}0 & {\mspace{14mu} \begin{matrix}{\ldots \mspace{14mu} {if}\mspace{14mu} {motif}\mspace{14mu} \left( {x,p} \right)\mspace{14mu} {is}\mspace{14mu} {not}\mspace{14mu} {found}\mspace{14mu} {in}\mspace{14mu} {the}} \\{m\text{-}{th}\mspace{14mu} {structure}\mspace{14mu} {of}\mspace{14mu} {frame}\mspace{14mu} n}\end{matrix}} \\{j\left( {n,m} \right)} & {\mspace{11mu} \begin{matrix}{\ldots \mspace{14mu} {if}\mspace{14mu} {motif}\mspace{14mu} \left( {x,p} \right)\mspace{14mu} {is}\mspace{14mu} {found}\mspace{14mu} {in}\mspace{14mu} {the}} \\{m\text{-}{th}\mspace{14mu} {structure}\mspace{14mu} {of}\mspace{14mu} {frame}\mspace{14mu} n}\end{matrix}\;}\end{matrix} \right.}$

For motif(x, p), the existence probability in the whole P_global(x, p)is represented as:

${{{P\_}{global}}\left( {x,p} \right)} = {\sum\limits_{n = 1}^{nmax}\frac{{P\_ local}\left( {x,p,n} \right)}{n\_ all}}$

In the target RNA, motif(x, p1) can be identified in which P_global(x,p) is 50% or more and p1=“stem is 5 base pairs”. Among them, motif(x,p2) can be further identified where p2=“left-right evenness (within onedifference between the 5′ side sequence and 3′ side sequence of theloop-flanking stem) and the length of the loop does not exceed 10”.

A sgASO binding site can then be located at the seven bases immediatelyafter each of the stem loops of motif (x, p2), and the followingcorrections can be processed: (1) the loop portion predicted to be threebases unwinds the next base pair to form a five-base loop; (2) when thenumber of base pairs in the mismatch or bulge of the stem is 2 or less,they are ignored in the counting of base pairs; and/or (3) when thenumber of base pairs in the mismatch or bulge of the stem is 3 or more,half of the number of base pairs in the mismatch or bulge is counted asbase pairs. This processing identifies the 5th base pair of the stemloop structure, and the immediate (3′ side) position can serve as thesite of sgASO binding.

One embodiment of the present invention relates to a method of designingan oligonucleotide (sgASO) for cleaving a target RNA in a eukaryoticcell, comprising (1) identifying in the target RNA sequence a sequencein which at least one stem-loop structure is formed, (2) identifying asequence of 6-10 bases adjacent to the stem loop structure on the 3′side as a sgASO binding sequence, and (3) identifying a sequencecomplementary to the binding sequence as a sgASO sequence.

Target Transcripts

Target RNAs are transcript RNAs, particularly mRNAs, of genes ofinterest (target genes) that suppress or abolish their expression, butmay be ncRNAs. Also, target RNAs include RNAs from the nuclear genome,RNAs from the mitochondrial genome, RNAs from the viral or bacterialgenome, and such. Although the sgASO used in the present invention doesnot necessarily need to be fully complementary to the target RNA, it istypically fully complementary to the target RNA. Suppression of theexpression of a target gene is reduction of the amount of proteintranscriptionally synthesized from that gene to 25% or less, preferably50% or less, more preferably 75% or less, and particularly preferably95% or less. The target gene is a gene whose suppression or loss ofexpression is of industrial value, particularly a gene whose increasedexpression is the cause of a particular disease (hereafter referred toas a pathogenic gene). Examples of such pathogenic genes include, forexample, the ras, erbb2, myc, apc, brcal, rb, Bcl-2, BGEF oncogenes,genes involved in hypertension such as renin, diabetes-related genessuch as insulin, hyperlipidemia-related genes such as LDL receptor,obesity-related genes such as leptin, arteriosclerosis disease-relatedgenes such as angiotensin, apolipoproteins and preserinins known to beresponsible for dementia, and senescence-related genes. These genes andtheir mRNA sequences are known in public databases (e.g., NCBInucleotides databases).

Pharmaceutical Compositions

Although small-guide antisense nucleic acids can also be formulatedalone, they are typically mixed with one or more pharmacologicallyacceptable carriers and preferably administered as pharmaceuticalformulations manufactured by any method well known in the art ofpharmaceutical sciences. Pharmaceutical compositions may includemixtures of multiple sgASOs with distinct sequences.

Targets for administration include humans or non-human animals, e.g.,non-human mammals. The most effective route of administration ispreferably used in the treatment and can be given orally orparenterally, such as intraoral, airway, rectal, subcutaneous,intramuscular, intravenous and transdermal, preferably intravenously.

Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups,capsules, tablets, powders, granules, and such. Liquid preparations suchas emulsions and syrups can be manufactured using water, sucrose,sorbitol, saccharides such as fructose, glycols such as polyethyleneglycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil andsoybean oil, antiseptics such as p-hydroxybenzoate esters, flavors suchas strawberry flavor, peppermint, and such as additives. Capsules,tablets, powders, granules, and such can be manufactured usingexcipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, etc.; excipientssuch as starch, sodium alginate, etc.; lubricants such as magnesiumstearate, talc, etc.; binding agents such as polyvinyl alcohol,hydroxypropyl cellulose, gelatin, etc.; surfactants such as fatty acidesters; plasticizers such as glycerin, and such as additives.

Formulations suitable for parenteral administration include injections,suppositories, and sprays. Injections are prepared using a saltsolution, a glucose solution, or a carrier consisting of a mixture ofboth. Suppositories are prepared using carriers such as cocoa fat,hydrogenated fat or carboxylic acid. Sprays are also prepared usingcarriers or such, which do not irritate the recipient's oral andrespiratory mucosa and disperse the active ingredient as fine particlesto facilitate absorption.

Examples of carriers include lactose, glycerin, liposomes, nanomicelles, and such. Due to the nature of the nucleic acids used in thepresent invention and even the carriers used, formulations such asaerosols, dry powders, and such can be made. Ingredients listed asexamples of excipient in oral formulations can also be added to theseparenteral.

The dosage or frequency of administration varies depending on theintended therapeutic effect, administration method, treatment period,age, and body weight, but is usually between 10 μg/kg and 100 mg/kg/dayfor adults.

One embodiment of the present invention is a pharmaceutical compositionfor use in the treatment or prevention of a disease or a disorder in apatient, comprising an oligonucleotide (sgASO) of about 7 mers, whereinthe oligonucleotide of about 7 mers is complementary to a target RNAassociated with a disease or disorder, the target RNA is capable offorming at least one stem-loop structure, the oligonucleotide of about 7mers is able to hybridize to a 3′-side region of the stem-loop structureto form at least one larger stem-loop structure in conjunction with thestem loop formed by the target RNA, and the formed structure isrecognized by tRNaseZ^(L) in the patient's body to cleave the targetRNA. The patient may be a human or a non-human animal. It should benoted that when referred to herein as approximately 7 mers, it isinterpreted to include 6 mers, 7 mers, and 8 mers.

SgASO is commonly, but not exclusively, designed to base-pair with thebase directly 3′ adjacent to the base that forms the root of thestem-loop structure formed by the target RNA (i.e., the terminal basepair opposite to the loop) and with the 3′ terminal base of the sgASO.For example, it may be designed so that base pairs are formed betweenthe 3′-terminal bases of the sgASO and the second to third bases countedfrom the root of the stem-loop structure formed by the target RNA.

In one embodiment of the present invention, the pharmaceuticalcompositions may comprise at least one sgASO of VIS-01 to VIS-07disclosed in the embodiment of the present invention. In one embodimentof the present invention, the pharmaceutical composition may be acomposition for the treatment or prevention of a cancer, or acomposition for use in the treatment or prevention of a cancer.

One embodiment in the present invention relates to a pharmaceuticalcomposition for the treatment or prevention of a cancer, or apharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of acancer, comprising a sgASO comprising or consisting of any sequenceselected from: 5′-GAAACUU-3′; 5′-CUGUCAA-3′; 5′-UCUUCAA-3′;5′-UUAUCGU-3′; 5′-CUUAUAA-3′; 5′-GCGGGGG-3′; 5′-ACUCAAA-3′. The sgASOmay have a phosphate group at one or both ends. Cancers for which thepharmaceutical composition may be used are those involving the Bcl-2gene, e.g., lymphoma.

Use in the Manufacturing of Pharmaceuticals and Treatment Methods

One embodiment of the present invention is the use of an oligonucleotide(sgASO) of about 7 mers in the manufacture of a pharmaceutical for usein the treatment or prevention of a disease or disorder in a patient,wherein the oligonucleotide of about 7 mers is complementary to a targetRNA associated with a disease or disorder, the target RNA is capable offorming at least one stem-loop structure, the oligonucleotide of about 7mers hybridizes to a 3′-side region of the stem-loop structure to format least one larger stem-loop structure in conjunction with the stemloop formed by the target RNA, and the formed structure is recognized bytRNaseZ^(L) in the patient's body to cleave the target RNA.

Further, one embodiment of the present invention relates to a method forthe treatment or prevention of a disease or disorder in a patient,comprising administering to the patient a sgASO of about 7 mers, whereinthe oligonucleotide of about 7 mers is complementary to a target RNAassociated with the disease or disorder, wherein the target RNA iscapable of forming at least one stem loop structure, wherein theoligonucleotide of about 7 mers is capable of hybridizing to a 3′-sideregion of the stem-loop structure to form at least one larger stem loopstructure in conjunction with the stem loop formed by the target RNA,wherein the formed structure is recognized by tRNaseZ^(L) in the patientto cleave the target RNA.

One embodiment of the present invention relates to the use of a sgASOcomprising or consisting of any sequence selected from: 5′-GAAACUU-3′;5′-CUGUCAA-3′; 5′-UCUUCAA-3′; 5′-UUAUCGU-3′; 5′-CUUAUAA-3′;5′-GCGGGGG-3′; 5′-ACUCAAA-3′ in the manufacture of a medicament for thetreatment or prevention of cancer.

Further, one embodiment of the present invention relates to a method forthe treatment or prevention of cancer in a patient, comprisingadministering to the patient a sgASO comprising or consisting of anysequence selected from: 5′-GAAACUU-3′; 5′-CUGUCAA-3′; 5′-UCUUCAA-3′;5′-UUAUCGU-3′; 5′-CUUAUAA-3′; 5′-GCGGGGG-3′; 5′-ACUCAAA-3′.

The present invention is specifically illustrated by demonstrating theexamples below; however, the present invention is not particularlylimited thereto.

Overview

Cancer was chosen as the target disease, and Bcl-2 downregulation wascontemplated as the therapy. To do so, an attempt was made to create anucleic acid drug targeting Bcl-2 mRNA. In the Structure Prediction andStructure Analysis section, the working hypothesis is that 1) the mRNAadopts a higher-order structure in a single strand on its own withoutprotein involvement, and 2) the single primary-structure mRNA ispresumed to adopt multiple higher-order structures and they are inequilibrium (i.e., the existence probabilities are distributed accordingto the amount of energy). Computation and evaluation of intrinsicpartial structures are based on this hypothesis. In addition, for thedesigning of sgASO, as tRNase Z^(L) can recognize a higher-orderstructure formed by the sgASO and intrinsic structure, it can behypothesized that for the intrinsic structure, 1) the loop is 10 basesor less, and 2) the stem is 5 base pairs.

EXAMPLES Example 1: Structure Prediction and Structure Analysis

Sequence information of the Bcl-2 mRNA (Accession NO. NM_000633.2) wasretrieved from the NCBI databases. Based on the sequence data, a300-base-wide frame was set at 3 nucleotides from the 5′ end (The firstframe ranges from base 1 (base 1) to base 300 at the 5′ end and thesecond frame ranges from base 4 to base 303. The same applies hereafter.nmax frames are given). In each of the frames, structure predicationsbased on pattern matching and thermodynamic stability were made for thesequence of the constituent 300 bases (see, e.g., Ref. Markham, N. R. &Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid meltingprediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; Markham, N. R. & Zuker,M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Functionand Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1,pages 3-31. Humana Press, Totowa, N.J. ISBN 978-1-60327-428-9). It ishypothesized that the state within the cell within which the mRNA isplaced is in equilibrium based on the predicted structure results andthe respective energy levels, and thus the existence probabilities arecalculated from each predicted structure result. Here, for theprediction result of mth from the most stable structure among thestructure prediction results of nth frame (in frame n, the number of thepredicted structure result obtained is mmax (n)), the existenceprobability of that predicted structure can be j(n, m).

Here, defining the partial structure found in each of the structureprediction results, which consists of only one loop site and only onestem complementary to each other, as the stem-loop structure (the term“complementary to each other” for the stem loop does not mean that itdoes not constitute any other stem loop even in other predictionstructure frames, but it means to never include a portion of anotherstem loop in a single prediction structure result). Here, the stem maycontain a mismatch (bases that do not participate in base pairing in thestem are opposing) or a bulge (bases that do not participate in basepairing in the stem are not opposing), but both ends are base pairs. Inaddition, the stem loop enclosed within the stem loop is also consideredas a separate stem loop (e.g., the loosened base pairs farthest from theloop of the stem are treated as separate stem loops from those that arenot loosened).

These stem loops are called motif(x, p) when they begin with theabsolute position x on the sequence rather than in the frame, and theproperty profiles of the constituting loops and stems (individualcharacteristics of the stem loops defined by the position of bases inthe stem-constituting base pairs) are designated as p. Then, theexistence probability within the frame n of motif(x, p) is set aspartial existence probability P_local(x, p, n), and the value is the sumof j values for the structures in which the stem loop exists in thestructure prediction results obtained in the n frame, i.e., Σj(n, m). Inaddition, when the result of summing from frame 1 to nmax for thisP_local(x, p, n) is taken as ΣP_local(x, p, n), and the number of framesin the full-length sequence constituting the stem loop which could fallwithin the frame is set as n_all(x, p), the existence probability ofmotif(x, p) in the whole, P_global(x, p), is represented as ΣP_local(x,p, n)/n_all(x, p).

Example 2: sgASO Sequence Design

Twelve sites were found in 5′ UTR and CDS and 3′ UTR of Bcl-2 mRNA insearch for motif(x, p1) with P_global(x, p) of 50% or more and p1=“stemis 5 base pairs”. Among them, there were seven motif (x, p2) in whichp2=“left-right evenness (within one difference between the 5′ sidesequence and 3′ side sequence of the loop-flanking stem) and the lengthof the loop does not exceed 10.”

A sgASO binding site can then be located at the seven bases immediatelyafter each of the stem loops of motif(x, p2), and the followingcorrections can be processed: 1) the loop portion predicted to be threebases unwinds the next base pair to form a five-base loop; (2) when thenumber of base pairs in the mismatch or bulge of the stem is 2 or less,they are ignored in the counting of base pairs; and (3) when the numberof base pairs in the mismatch or bulge of the stem is 3 or more, half ofthe number of base pairs in the mismatch or bulge is counted as basepairs. This processing identifies the 5th base pair, and the site ofsgASO binding is immediately after that.

As a result, the sequences of binding sites where sgASO is expected tobe effective are AAGUUUC, UUGACAG, UUGAAGA, ACGAUAA, UUAUAAG, CCCCCGC,and UUUGAGU; and the following 7-mer antisense oligos (VIS-01 to VIS-07)were synthesized (synthesis by Nippon Bio-Service Co., Ltd.),respectively.

Target sgASO Sequence Name Sequence Number AAGUUUC VIS-015′-pGAAACUUp-3′  8224 UUGACAG VIS-02 5′-pCUGUCAAp-3′  7889 UUGAAGAVIS-03 5′-pUCUUCAAp-3′ 14289 ACGAUAA VIS-04 5′-pUUAUCGUp-3′ 15580UUAUAAG VIS-05 5′-pCUUAUAAp-3′  7985 CCCCCGC VIS-06 5′-pGCGGGGGp-3′ 9899 UUUGAGU VIS-07 5′-pACUCAAAp-3′  1857

Example 3: Cell Experiments

The inhibition of Bcl-2 mRNA expression by the above sgASO (VIS-1 toVIS-7) was carried out using the human leukemic cell line HL60. All ofthe nucleic acid chains were phosphorylated at both ends, and the 2′OHmoiety was O-methylated. One previously reported sgASO, Hep (Sequence:GGGCCAG; see Japanese Patent No. 5995849 and Cancer Letters 328 (2013)362-368), was also used as a reference. HL60 cells were cultured in24-well plates at a density of 10,000 cells/500 μL in RPMI-1640 medium(containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin) at37° C. in a 5% CO2 incubator. Each sgASO was added to the culture mediumto reach a final concentration of 1 μM and then cultured for 48 hours.Forty-eight hours later, total RNA was extracted from HL60 cells usingRNAisoPlus, and quantitative RT-PCR was performed. The level of GAPDHmRNA was used as an internal control, and the level of Bcel-2 mRNA wasnormalized. As a result, VIS-1 and VIS-5 were obtained as sgASO thatshowed a two-fold activity relative to that of Hep1, a previouslyreported sgASO (FIG. 1). The results revealed that the methods fordesigning and identifying sgASO according to the present invention aresuperior to the prior art.

The present specification shows the preferred embodiments of the presentinvention, and it is clear to those skilled in the art that suchembodiments are provided simply for the purpose of exemplification. Askilled artisan may be able to make various transformations, and addmodifications and substitutions without deviating from the presentinvention. It should be understood that the various alternativeembodiments of invention described in the present specification may beused when practicing the present invention. Further, the contentsdescribed in all publications referred to in the present specification,including patents and patent application documents, should be construedas being incorporated the same as the contents clearly written in thepresent specification by their citation.

INDUSTRIAL APPLICABILITY

The present inventors developed a method to efficiently regulate geneexpression in cells using relatively short oligonucleotides bypredicting the target RNA sequences subject to gene expressionregulation based on the sequence information, calculating the existenceprobabilities from the predicted structure results obtained and theirrespective energy levels, and establishing a method for designing asgASO from the existence probabilities and stem-loop structures. Thistechnique is useful for the treatment or prevention of various diseasesand disorders, as it can in principle be applied to the regulation ofany gene expression.

1. A method for cleaving a target RNA in a eukaryotic cell, comprising:i) identifying a sequence in the target RNA sequence where at least onestem-loop structure is formed through hybridization of a complementary6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) to the target RNA; and ii)preparing the sgASO and contacting it with the target RNA in theeukaryotic cell, wherein the stem-loop structure formed through sgASOhybridization is recognized by tRNaseZ^(L) within the eukaryotic cell tocleave the target RNA.
 2. The method according to claim 1, wherein thenumber of base pairs in the stem portion of the stem-loop structureformed through sgASO hybridization is 11 to
 14. 3. The method accordingto claim 1, wherein the sgASO is a 7-mer.
 4. The method according toclaim 1, wherein the loop portion in the stem-loop structure formedthrough sgASO hybridization is formed by the target RNA.
 5. The methodaccording to claim 1, wherein the number of bases in the loop portion ofthe stem-loop structure formed through sgASO hybridization is 3 to 10.6. The method according to claim 1, wherein the stem portion of thestem-loop structure formed through sgASO hybridization does not containa mismatch or bulge.
 7. The method according to claim 1, wherein thestem portion of the stem-loop structure formed through sgASOhybridization contains a mismatch or bulge.
 8. The method according toclaim 7, wherein in counting the number of base pairs in the stemportion, when the number of base pairs in the mismatch or bulge of thestem is 2 or less, the mismatch or bulge is considered to form a basepair and counted; and when the number of base pairs in the mismatch orbulge of the stem is 3 or more, half of the number of bases in themismatch or bulge is counted as base pairs.
 9. The method according toclaim 1, wherein the target RNA is mRNA or ncRNA.
 10. The methodaccording to claim 1, wherein the sgASO comprises a modified nucleosideand/or a modified internucleoside linkage.
 11. The method according toclaim 1, wherein the difference in the number of bases between the 5′side sequence and 3′ side sequence of the stem portion formed by thetarget RNA is 1 or less.
 12. The method according to claim 1, whereinone or both of the terminal hydroxyl groups of the sgASO are modified.13. The method according to claim 1, wherein a phosphate group is addedto one or both of the terminal hydroxyl groups of the sgASO.
 14. Themethod according to claim 1, wherein when the bases constituting thesgASO-bound region on the target RNA from the 5′ end are N1, N2, N3, N4,N5, N6 and N7, and the first base adjacent to the 3′ end of the regionto which the sgASO binds is N8, at least one of the conditions 1-3 belowis met: condition 1: N8 is A or G; condition 2: N7 is C; and condition3: N6 is A, C or G.
 15. The method according to claim 1, wherein thesgASO is an oligonucleotide selected from the group consisting of anyone sequence from SEQ ID NO.: 1 to SEQ ID NO.:
 16384. 16. A method fortreating or preventing a disease or disorder in a patient, comprisingadministering to the patient an oligonucleotide of about 7 mers, whereinthe oligonucleotide is complementary to the target RNA associated withthe disease or disorder, the target RNA can form at least one stem-loopstructure, the oligonucleotide can hybridize to the 3′ side region ofthe stem loop structure to form at least one larger stem loop structurein conjunction with the stem loop formed by the target RNA, and whereinthe formed structures are recognized by tRNaseZ^(L) in the patient'sbody and the target mRNA is cleaved.
 17. A method for treating orpreventing cancer in a patient, comprising administering to the patienta sgASO comprising a sequence selected from the group consisting of:5′-GAAACUU-3′; 5′-CUGUCAA-3′; 5′-UCUUCAA-3′; 5′-UUAUCGU-3′;5′-CUUAUAA-3′; 5′-GCGGGGG-3′; and 5′-ACUCAAA-3′.


18. A method for designing an oligonucleotide (sgASO) to cleave a targetRNA in a eukaryotic cell, comprising: i) identifying a sequence in thetarget RNA sequence in which at least one stem-loop structure is formed;ii) identifying a sequence of 6 to 10 bases on the 3′ side adjacent tothe stem-loop structure as a sgASO-binding sequence; and iii)identifying a sequence complementary to the binding sequence as a sgASOsequence.
 19. The method for designing an oligonucleotide (sgASO)according to claim 18, wherein i) the number of base pairs in the stemportion of the stem-loop structure formed by the target RNA is 4 to 8;ii) the number of bases in the loop portion of the stem-loop structureis 3 to 10; iii) when the stem portion of the stem-loop structurecontains a mismatch or bulge, in the counting the number of base pairsin the stem portion, when the number of base pairs in the mismatch orbulge of the stem is 2 or less, the mismatch or bulge is considered toform a base pair and counted; and when the number of base pairs in themismatch or bulge of the stem is 3 or more, half of the number of basesin the mismatch or bulge is counted as base pairs; and iv) thedifference in the number of bases between the 5′-side sequence and3′-side sequence of the stem portion is 1 or less.
 20. A method ofdesigning a small guide antisense oligonucleotide (sgASO), comprising:(1) identifying a stem loop with a high existence probability on thetarget RNA; (2) evaluating the stem loop; and (3) setting the sevenbases immediately 3′ to the stem loop-forming base pair as the targetsequence (sense strand) and identifying its antisense strand to be asgASO sequence, wherein the identifying a stem loop with a highexistence probability on the target RNA comprises: i) predicting astructure, comprising setting a frame n having a width of W bases by anincrement of R bases starting from the 5′ end, wherein the number of theresulting frames is nmax, computing a base-pair pattern which isobtained by pattern matching for the constituent base sequence of the Wbases in each frame n, applying known thermodynamic stabilitycalculations to the result, and providing a ΔG for each base-pairpattern; ii) analyzing a structure, comprising hypothesizing based onthe resulting mmax(n) structures predicted in frame n and respectiveenergy level, that the state inside the cell within which the RNA isplaced is in equilibrium, calculating the existence probability of eachresulting predicted structure according to Maxwell-Boltzmann statistics,wherein the existence probability of each predicted structure result isj(n, m) for the mth predicted result from the most stable structureamong the resulting predicted structures in frame n; iii) calculating alocal existence probability, comprising setting p as a property profileof a loop and stem (characteristics of the stem loop defined by theposition of base in the stem-constituting base pair) formed beginningfrom the absolute position x on the sequence rather than in the frame,and defining the stem-loop as motif(x, p), and defining an existenceprobability in frame n of the motif(x, p) as partial existenceprobability P_local(x, p, n), and calculating the value as sum Σj(n, m)of the j values for the prediction results of structures in which thestem loop exists among all the resulting predicted structures obtainedin the frame n, wherein the local existence probability P_local(x, p, n)of motif(x, p) in the frame n is represented below:${{P\_ local}\left( {x,p,n} \right)} = {\sum\limits_{m = 1}^{{mmax}{(n)}}\left\{ \begin{matrix}0 & {\mspace{14mu} \begin{matrix}{\ldots \mspace{14mu} {if}\mspace{14mu} {motif}\mspace{14mu} \left( {x,p} \right)\mspace{14mu} {is}\mspace{14mu} {not}\mspace{14mu} {found}\mspace{14mu} {in}\mspace{14mu} {the}} \\{m\text{-}{th}\mspace{14mu} {structure}\mspace{14mu} {of}\mspace{14mu} {frame}\mspace{14mu} n}\end{matrix}} \\{j\left( {n,m} \right)} & {\mspace{11mu} \begin{matrix}{\ldots \mspace{14mu} {if}\mspace{14mu} {motif}\mspace{14mu} \left( {x,p} \right)\mspace{14mu} {is}\mspace{14mu} {found}\mspace{14mu} {in}\mspace{14mu} {the}} \\{m\text{-}{th}\mspace{14mu} {structure}\mspace{14mu} {of}\mspace{14mu} {frame}\mspace{14mu} n}\end{matrix}\;}\end{matrix} \right.}$ iv) calculating the existence probability,comprising providing the existence probability P_global(x, p) ofmotif(x, p) among the entirety as ΣP_local(x, p, n)/n_all(x, p) whenΣP_local(x, p, n) is the result of sum of P_local(x, p, n) from frame 1to nmax, and the number of frames in which the full length of thesequence constituting the stem-loop is contained within the frame isn_all(x, p), wherein the existence probability of motif(x, p) among theentirety is represented as below; and${{{P\_}{global}}\left( {x,p} \right)} = {\sum\limits_{n = 1}^{nmax}\frac{{P\_ local}\left( {x,p,n} \right)}{n\_ all}}$v) analyzing, comprising selecting a stem-loop based on the existenceprobability and property p, with respect to the obtained existenceprobability P_global(x, p) of motif(x, p).